本法可使抗體(ti)或其它蛋(dan)白質的ε-氨基通(tong)過(guo)手(shou)臂與酰化的生物素共價結(jie)合(he)。其后(hou)，生(sheng)物(wu)素化的分(fen)子可應用酶標-親和(he)素或熒光染料-鏈霉親和(he)素復合(he)物(wu)來檢測。小分(fen)子的水溶性生(sheng)物(wu)素對細菌蛋白鏈霉親和(he)素具有高度親和(he)力是本法的設計基礎。

原料：

NHSB：N-羥基琥珀(po)酰(xian)亞胺(an)生物素(su)

0.1 mol/L 碳酸氫鈉緩沖液(ye)，pH 8.0

雙蒸(zheng)水（注意去除游離氨基(ji)），用以配制碳酸氫(qing)鈉(na)緩(huan)沖液或硼酸緩(huan)沖液

DMSO（二甲亞砜，有毒試劑）

1 mol/L NH4Cl

疊氮鈉（有(you)毒試劑）

PBS

10g/L牛血清白蛋白（W/W）PBS液

分子篩柱（如G25）

電磁攪拌器

透析袋（MW CO 8000）

鋁鉑

微量移液器(qi)

步驟：

1. 將待生(sheng)物素化的(de)蛋白質用(yong)0.1 mol/L 碳酸(suan)氫鈉緩(huan)沖液（pH 8.0）或0.5 mol/L 硼(peng)酸(suan)緩(huan)沖液（pH 8.6）稀釋(shi)到1 mg/ml，一般實驗室應(ying)用(yong)的(de)生(sheng)物素化體積(ji)為1~2.5 ml。

2. 交互用0.1 mol/L 碳(tan)酸(suan)氫鈉緩沖液（pH 8.0）或0.5 mol/L 硼酸(suan)緩沖液（pH 8.6），對蛋白質(zhi)充分透(tou)析。

3. 用(yong)1 ml DMSO 溶解(jie)NHSB 1 mg。

4. 向1 ml 蛋白(bai)(bai)質溶(rong)液（即含(han)蛋白(bai)(bai)質1 mg）加入120 μl NHSB溶(rong)液（即含(han)NHSB 120 μg）。

5. 在室(shi)溫下持續攪拌(ban)，保溫2~4小時。

6. 加入9.6 μL1 mol/L NH4Cl （每25 μg NHSB 加1 μl），在室溫下(xia)攪拌10分(fen)鐘。

7. 在4℃，對PBS充分透析，以(yi)除去(qu)游離的生物素。

8. 將(jiang)樣品(pin)上1 ml 的(de)分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集(ji)1 ml/管，蛋(dan)白質在1~3 ml 之間洗下(xia)。

9. 最(zui)后，樣品加入(ru)疊氮(dan)鈉(na)（終(zhong)濃度0.5 g/L）及(ji)1.0 g/L BSA。將結(jie)合(he)產物置4℃，避光(guang)保存(cun)，亦可加入(ru)50%重蒸甘油，置-20℃保存(cun)。

要點：

1. 如在反(fan)應(ying)混合液(ye)中有疊(die)氮鈉或游離氨基存在，會(hui)抑制標記(ji)反(fan)應(ying)。因此，蛋白質在反(fan)應(ying)前要(yao)對0.1 mol/L 碳酸氫鈉緩(huan)沖液(ye)或0.5 mol/L 硼酸緩(huan)沖液(ye)

2. 所用的(de)NHSB及待生物(wu)素化蛋白質之間的(de)分(fen)子比按(an)蛋白質表面的(de)ε-氨基的(de)密度會有所不(bu)同，選(xuan)(xuan)擇不(bu)當則(ze)影響標記的(de)效(xiao)率，應先用幾個(ge)不(bu)同的(de)分(fen)子比來篩選(xuan)(xuan)最適條件。

3. 用NHSB量過量也是不利的(de)，抗原的(de)結合位點(dian)可能因(yin)此(ci)被(bei)封閉(bi)，導致抗體失(shi)活。

4. 由于抗體的氨基不易接近可能(neng)造成生物素(su)化(hua)不足，此時可加入(ru)去污劑如(ru)Triton X-100，Tween 20等。

5. 當游離ε-氨(an)基（賴氨(an)酸殘基的(de)氨(an)基）存在于抗(kang)體(ti)的(de)抗(kang)原結合(he)(he)位(wei)點(dian)時(shi)(shi)，或位(wei)于酶的(de)催(cui)化位(wei)點(dian)時(shi)(shi)，生物素化會降低或損傷抗(kang)體(ti)蛋白的(de)結合(he)(he)力或活性(xing)。此時(shi)(shi)，應試(shi)用(yong)其它交(jiao)聯方(fang)法。

6. 生(sheng)物素(su)還可能與(yu)不同的功(gong)能基(ji)(ji)團，如羰基(ji)(ji)、氨基(ji)(ji)、巰基(ji)(ji)、異咪唑基(ji)(ji)及苯(ben)酚基(ji)(ji)，也可與(yu)糖基(ji)(ji)共價結合。

7. 交聯反應后，應充分透析，否則，殘余的(de)生(sheng)物素會對生(sheng)物素化抗體與親和素的(de)結(jie)合產生(sheng)競爭作用(yong)。

8. 在細胞的(de)熒光標記(ji)實(shi)驗中，中和(he)(he)親(qin)(qin)和(he)(he)素的(de)本(ben)底低，但由于鏈(lian)霉親(qin)(qin)和(he)(he)素含有少(shao)量正(zheng)電荷(he)，故對某些細胞可(ke)導致高本(ben)底。