免(mian)疫診斷試劑(ji)是廣泛應用(yong)的一種(zhong)測(ce)試系列，通(tong)過抗體(ti)-抗原結合來檢測(ce)特定(ding)目標。這可能(neng)涉及(ji)使(shi)用(yong)實(shi)驗性(xing)抗體(ti)來檢測(ce)特定(ding)蛋白質(zhi)的存(cun)在，也可能(neng)使(shi)用(yong)重組蛋白來檢測(ce)天(tian)然抗體(ti)的存(cun)在。

在開發、使用免疫診斷試劑或排除故障時，都需要考慮一些共同的影響因素以獲得最佳反應體系系統。本文將介紹一些技巧和竅門，以幫助完善免疫診斷試劑并取得最佳測試結果。

1. 主要原料選擇

花時間選擇一個好的免疫原料會節省大量的檢測開發時間，并產生更好質量的免疫診斷試劑。所選擇的免疫原料最好是純的，并且結構上與目標分析物相同。建議嘗試多個廠家(jia)抗體，這可(ke)能包括同(tong)一目標的不(bu)同(tong)表位抗體、多克隆(long)(long)與(yu)單克隆(long)(long)抗體、不(bu)同(tong)宿主(zhu)物種(zhong)的抗體，甚至不(bu)同(tong)供應商提供的抗體。

抗體(ti)即使是來自不(bu)同(tong)批次或供應商的(de)(de)(de)相(xiang)同(tong)抗體(ti)，也(ye)會在(zai)檢測效果上表現出固有差異。不(bu)同(tong)表位的(de)(de)(de)抗體(ti)在(zai)不(bu)同(tong)樣品類型(xing)或條件下結合的(de)(de)(de)可(ke)用(yong)性也(ye)可(ke)能不(bu)同(tong)，所以確保檢測方法與(yu)實際使用(yong)的(de)(de)(de)樣品類型(xing)相(xiang)匹(pi)配。

2. 其他輔料影響因數

雖然抗原抗體是免疫檢測的核心，但實驗過程中還涉及一系列其他試劑和材料，這些因素將對檢測結果產生重要影響。

以Western blot為例，可以利用多種具有不同特性(xing)的(de)膜類型進行(xing)印(yin)跡(ji)。即使選擇(ze)(ze)了一種膜類型，在(zai)(zai)不同制(zhi)造商生產(chan)的(de)(de)(de)同等(deng)膜之間也可能存在(zai)(zai)性能上的(de)(de)(de)差異，橫向流動膜也是如此(ci)(ci)。在(zai)(zai)使用塑料器皿固(gu)定的(de)(de)(de)免疫(yi)診斷試劑如ELISA時(shi)(shi)，可供(gong)選擇(ze)(ze)的(de)(de)(de)材料和表面(mian)處理以及結合特性各不相同，這些(xie)因素都會影響測定的(de)(de)(de)有(you)效性。因此(ci)(ci)，在(zai)(zai)選擇(ze)(ze)合適的(de)(de)(de)試劑時(shi)(shi)，不要滿足于手頭的(de)(de)(de)材料，而是嘗試不同的(de)(de)(de)選擇(ze)(ze)和不同品牌，并進行平行試驗以找(zhao)到最佳結果的(de)產品。

3. 提供穩定的緩沖液

緩沖液(ye)提供了免疫診(zhen)斷試(shi)劑中的反應環境(jing)，所以選擇合適的緩沖液(ye)條件(jian)非常(chang)重(zhong)要。除了嘗(chang)試(shi)不同(tong)的緩沖溶(rong)液(ye)外，還需要嘗(chang)試(shi)不同(tong)濃度(du)的溶(rong)液(ye)。

即使是微小的濃(nong)度差(cha)異(yi)也(ye)可能導致檢測成(cheng)功或(huo)失敗。這(zhe)不僅適用(yong)(yong)于檢測過(guo)程(cheng)本身的緩(huan)沖(chong)液(ye)(ye)，也(ye)適用(yong)(yong)于上(shang)游(you)過(guo)程(cheng)中使用(yong)(yong)的緩(huan)沖(chong)液(ye)(ye)，如重組蛋(dan)白的制備或(huo)樣品的儲存(cun)，因為這(zhe)些緩(huan)沖(chong)液(ye)(ye)可能會帶入免疫檢測中并產生干擾(rao)，一(yi)定程(cheng)度上(shang)破壞了(le)主(zhu)要(yao)原材料的穩定性。

4. 妥善保管樣品

即(ji)使掌(zhang)握了最佳的檢測方(fang)法，樣(yang)品質量(liang)差或未得到適當保(bao)管(guan)也可(ke)能(neng)導致失望的結(jie)(jie)果。從采集樣(yang)品開始(shi)，就要(yao)妥(tuo)善保(bao)管(guan)好(hao)樣(yang)本，我(wo)們在實(shi)際開發過程(cheng)中，樣(yang)本往(wang)往(wang)是(shi)醫院帶回來的，在帶回途中必須控制好(hao)儲(chu)存穩定(ding)！樣(yang)本包括血液、血漿、血清(qing)、組織、細(xi)胞、微(wei)生物(wu)等，保(bao)管(guan)得越(yue)好(hao)，結(jie)(jie)果就越(yue)相(xiang)關和有意(yi)義(yi)。

特別是對于臨(lin)床診(zhen)斷(duan)試劑，保存(cun)時間會(hui)影(ying)響陽性(xing)和陰性(xing)結(jie)果，不論是假陰性(xing)還是假陽性(xing)結(jie)果都是不希望(wang)看到(dao)的。隨著(zhu)時間推移(yi)，蛋白質（包括抗(kang)體）會(hui)降解(jie)，而溫度升高、pH值變化(hua)、滲透壓(ya)變化(hua)和破壞性(xing)化(hua)學物質等(deng)因(yin)素會(hui)加(jia)速降解(jie)。

理想的保管條件主要取決(jue)于樣品類(lei)型，所以做足功課很重要。通常，低(di)溫(wen)和生物相關的緩沖(chong)條件可能是(shi)最好的選擇(ze)。但對(dui)(dui)某(mou)些樣品類(lei)型可能導(dao)致目(mu)標蛋(dan)白(bai)的損傷和降解，反復(fu)凍融對(dui)(dui)大多數樣品肯定是(shi)有害的，必須要去醫院拿新鮮樣本測(ce)試開(kai)發。

5. 徹底清洗反應體系

許多免(mian)疫診斷試劑(ji)都是多組分試劑(ji)，需(xu)要儀器進(jin)行多次(ci)吸取(qu)不同試劑(ji)組分和樣本，在(zai)完成最終動作(zuo)之后就必須進(jin)行清洗(xi)。雖然清洗(xi)步驟可能(neng)(neng)看起來不那么重要，但它們卻是至關重要的(de)。清洗(xi)不徹底會導(dao)致高背景(jing)信(xin)號(hao)，產(chan)生“噪音(yin)”結果(guo)。另(ling)一方面，過(guo)度清洗(xi)可能(neng)(neng)使信(xin)號(hao)減弱(ruo)甚至消(xiao)失。

在其他方法(fa)學上，不(bu)一(yi)致的(de)(de)洗滌(di)還會帶來其他問題，導致實驗內和(he)實驗間的(de)(de)差(cha)異以及結果解釋上的(de)(de)困難。當(dang)整個板塊(kuai)或樣品(pin)出現無法(fa)解釋的(de)(de)變化(hua)時，可能(neng)是由于單個實驗中(zhong)的(de)(de)洗滌(di)不(bu)一(yi)致造成(cheng)的(de)(de)。

以96孔板式檢測為例，如ELISA，在使用自動洗板機時，最好檢查所有孔是否被均勻清洗。由于自動洗板機所需的細管易堵塞，因此在派發實驗板之前，用一個空板檢查所有孔是否均勻分配和排空。如果使用(yong)多(duo)通(tong)道移液器(qi)手動(dong)進行操作，請(qing)確保所有吸頭牢固、平(ping)衡地安(an)裝，以防止洗(xi)(xi)(xi)滌(di)液的分(fen)配和排(pai)空不均。例如，在清(qing)洗(xi)(xi)(xi)膜(mo)時，確保膜(mo)完全(quan)浸(jin)沒，因為暴露部分(fen)將(jiang)保持未(wei)被(bei)清(qing)洗(xi)(xi)(xi)。使用(yong)磁力攪拌器(qi)輕輕攪拌洗(xi)(xi)(xi)滌(di)液也(ye)是一個好主(zhu)意（不要過于用(yong)力，以免損壞膜(mo)），以使洗(xi)(xi)(xi)滌(di)液在整個膜(mo)上均勻循(xun)環。

6. 使用質控品

與(yu)大多數測試一樣，包括適(shi)當(dang)的(de)質(zhi)控很重要，以(yi)確定(ding)實驗過(guo)程中獲得的(de)結果的(de)有效性。不包括質(zhi)控意味著無論結果看起來(lai)多么好(hao)，都是沒有意義的(de)。

陰性質控可(ke)以將(jiang)無信號解釋為沒有(you)目標存在，而不僅(jin)僅(jin)是檢測(ce)失(shi)敗。例如，在許多LFA中，即使測(ce)試帶是陰性的，也會包括(kuo)一個控(kong)制線(xian)以確認(ren)檢測(ce)成功。同樣地，陽性質控表明了目(mu)標存(cun)在于樣品中的信號。

例如(ru)，在 Western Blot 檢測(ce)細胞裂解液中特(te)定(ding)蛋白時(shi)，同時(shi)進行(xing)純化的(de)目標(biao)蛋白樣品可幫(bang)助(zhu)(zhu)識別背景信號中的(de)目標(biao)帶。質控品跨越目標(biao)濃度或表達水(shui)平范圍也有助(zhu)(zhu)于解釋(shi)未(wei)知樣品中的(de)水(shui)平，對定(ding)量(liang)或半定量測定(ding)特(te)別重要。對于ELISAs，確(que)定病人樣品(pin)中(zhong)某(mou)種抗(kang)體的水平是(shi)低、中(zhong)還是(shi)高(gao)，有助于臨床解釋，并(bing)確(que)保(bao)結果保(bao)持(chi)在檢(jian)測動態范圍(wei)內。

7. 考慮同時檢測多個目標

在一次檢(jian)測中同時(shi)(shi)檢(jian)測多個(ge)目(mu)標可(ke)(ke)能是可(ke)(ke)取的(de)(de)。添加一個(ge)以上的(de)(de)目(mu)標到(dao)診(zhen)斷測試中可(ke)(ke)以提高測定的(de)(de)可(ke)(ke)靠性、敏感性和特(te)(te)異性，特(te)(te)別是當目(mu)標可(ke)(ke)能丟(diu)失或變異到(dao)不(bu)能有(you)效檢(jian)測時(shi)(shi)。此(ci)外(wai)，宿主對抗原(yuan)的(de)(de)反(fan)應存在自然差異，因此(ci)將(jiang)不(bu)同的(de)(de)目(mu)標組合(he)在一起，可(ke)(ke)以從(cong)一個(ge)樣品(pin)中檢(jian)測多個(ge)病原(yuan)體或與之相關(guan)的(de)(de)免疫反(fan)應。

這些(xie)建議的目的是幫(bang)助優化免(mian)疫診斷試劑(ji)并獲得最佳結果(guo)。