在分子(zi)生物學實驗(yan)中，堿裂(lie)解法是一種常(chang)用的(de)提取質粒DNA的(de)方法。然(ran)而，有時(shi)會出(chu)現堿裂(lie)解法提取的(de)質粒溶液(ye)中不含DNA和RNA的(de)情況，這涉(she)及多個方面的(de)因素.......

第一，我們需要了解堿裂解法的基本原理和正常操作流程。

堿裂解法主要依賴三(san)種溶液的作用：

溶液I：用于重懸菌體，其成分包括葡萄糖、Tris-Cl和EDTA，葡(pu)萄糖增(zeng)加(jia)粘(zhan)稠度，減(jian)少搖晃時對DNA的(de)機械(xie)剪(jian)切(qie)力，EDTA則螯(ao)合二價金屬離子，抑制(zhi)DNase的(de)活性(xing)和微生物生長。

溶液II：含(han)有NaOH和SDS，NaOH負責(ze)裂解(jie)菌體細(xi)胞壁、在細(xi)胞膜上穿孔，釋放質粒，而(er)SDS為下一(yi)步操作做鋪墊。

溶液III：則用于沉淀雜質，其中KAc置換SDS中(zhong)的鈉(na)離子形成不溶性(xing)的PDS，HAc中(zhong)和NaOH，防(fang)止長時(shi)間的堿性(xing)條(tiao)件打(da)斷(duan)DNA。、

正常情況下，經過這一系列操作以及后續的酚/氯仿/異戊(wu)醇(chun)抽提和酒精沉淀，應該能夠獲得含有(you)質(zhi)粒(li)DNA的溶液。

第二，為什么會出現提取的質粒溶液中不含DNA和RNA的情況呢？

從操作過程來(lai)看，存在以下關鍵(jian)問(wen)題(ti)：

1，在溶液I的使用環節，如果菌體沒有懸浮均勻，存在結塊現象，就會導致后續的裂解不充分。部分菌體沒有被完全裂解，其中的質粒DNA就無法釋放出來，最終導致提取的溶液中沒有DNA。

2，溶液II的操作也至關重要，NaOH必須使用新鮮的，因為如果NaOH吸收了空氣中的CO2，堿性會減弱，無法有效溶解大腸桿菌，從而難以高效率抽提得到質粒。而且，裂解細胞過程中，堿(jian)處理的時間要短且不能(neng)激烈振蕩(dang)。若堿(jian)處理時間過長(chang)或振蕩(dang)過于劇烈，基因組(zu)DNA容(rong)易(yi)發生斷(duan)裂，50 -100kb大小的片斷(duan)就無(wu)法(fa)被PDS共沉淀，會混入最終(zhong)的溶液中，同時也可能(neng)破壞質粒(li)(li)DNA的結構，導(dao)致無(wu)法(fa)有(you)效提取到質粒(li)(li)DNA。

3，溶液III加入后，會出現大量沉淀，這與SDS的加入有關。如果在溶液II中未添加SDS，雖然也會有少量沉淀，但沉淀效果不佳，無法有效去除雜質，影響最終質粒的提取。而HAc若(ruo)未能有效(xiao)中和NaOH，長時間的(de)(de)堿性(xing)環(huan)境會打斷DNA，使(shi)得DNA無法(fa)完整(zheng)地存(cun)在(zai)于(yu)最終(zhong)的(de)(de)質(zhi)粒溶液中。

4，酚/氯仿/異戊醇抽提步驟也不容忽視，酚對蛋白質的變性作用強，但水飽和酚比重略比水重，在高濃度鹽溶液中離心后酚相會跑到上層，不利于含質粒的水相回收，所以加入氯仿增加比重，使酚/氯仿始終在下層方便回收水相，而異戊醇讓離心后上下層界面更清晰。如果在這個抽提過程中操作不當，例如分層不清晰導致水相回收失敗，或者酚/氯仿比例不準確，都可能導致質粒DNA丟失。另外(wai)，若單獨(du)用酚抽提后未(wei)用氯仿去除水相中(zhong)的(de)(de)酚，酚會抑(yi)制后續的(de)(de)酶反(fan)應(ying)，也(ye)可能影響質粒(li)的(de)(de)提取和(he)檢測，給人溶液中(zhong)不含DNA的(de)(de)假象(xiang)。

5，酒精沉淀環節，回收后的水相含有足夠多的鹽，加入2倍體積的乙醇在室溫放置幾分鐘后離心可沉淀出質粒DNA。但如果放置在-20℃時間過長，會導致大量鹽的沉淀，干擾質粒DNA的沉淀，甚至可能誤認為沒有提取到質粒DNA。

此外，最終溶解質粒的TE緩沖(chong)液若存(cun)在問題，比如其中的RNase活性不(bu)足，無法有(you)效降解RNA，或者(zhe)TE緩沖液本身被污染，都可能導致RNA殘留或質粒DNA被破壞，從(cong)而出現(xian)溶(rong)液中看似不(bu)含(han)DNA和RNA的情況(kuang)。